Pseudomonas ... (rákos megbetegedés)

Kilenc leander fajta Pseudomonas savastanoi ssp. nerii („leanderrák” okozója) fertőzéssel szemben mutatott rezisztenciája

Kilenc leander fajta „leanderrák” elleni rezisztenciája került vizsgálatra. A fajták egyike sem mutatott teljes rezisztenciát a 3, eltérő virulenciával rendelkező Pseudomonas savastanoi ssp. nerii (Psv) baktérium csoporttal szemben, ám szignifikáns különbséget mutattak a törzsek által okozott klinikai tünetek tekintetében. A legérzékenyebb a „Sötét lazac” fajta (sötét lazac színű virágú) volt, ahol a hajtások, a levelek és a magtokok egyaránt deformálttá váltak, másodlagos csomók jelentek meg, míg a legkevésbé érzékeny „Fehér” fajtán (fehér virágú) a legkevésbé virulens törzzsel fertőzve sem helyi csomók nem alakultak ki az oltás helyén, sem másodlagos tünetek nem voltak felfedezhetők. Levéldarabok szúrásos fertőzésével olyan in vitro (mesterséges kísérleti feltételek közötti) teszt lett kifejlesztve, amely alkalmas a rezisztencia meghatározására.

Leanderrák tünetei

 

Bevezetés

A leander (Nerium oleander) világszerte termesztett dísznövény. Őshonos Európa Mediterrán régiójában, valamint Ázsia délnyugati részén, de sokfelé nagyon könnyen is megtelepíthető. Elterjedten szaporítják, különösen a meleg és a szubtrópusi területeken, ahol a parkokban és az utak mentén szabadon nő. Közép- és Nyugat-Európában télikertekben és balkonnövényként tartják.

Pagen 1988-ban 401 fajtát, variációt tartalmazó nem hivatalos fajtajegyzéket állított össze, amelyek közül 145 fajta napjainkban is megtalálható a kereskedelemben. A leanderek alakjukat, viráguk színét, illatát és formáját tekintve különböznek egymástól (Pagen 1988). Szicíliában nagyszámú leander variáció található, amelyek többnyire a virág színe és alakja alapján vannak elkülönítve (Romano és mtsai. 2003).

A leanderrák egyike a legelterjedtebb leander betegségeknek. Az olajfa csomós megbetegedéséhez hasonlóan a baktérium által termelt fitohormon hatására csomók képződnek a leander hajtásain, ágain és a leveleken (Surico és Iacrobellis 1992). A baktérium hatására szintén deformálódik a virágzat, a magtok és/vagy csökken a virágzás, és elhalhat a bibe (Smith, 1928). Súlyos betegség alakul ki, mert a kórokozó behatol a tejcső rendszerbe és azon terjedve másodlagos csomókat képez szerte a növényben (Wilson és Magie 1964).

A leanderrák szisztémás formája súlyosan csökkenti a növény esztétikai értékét. Ráadásul az egyszer behurcolt fertőzést többé nem lehet kiirtani és az endophyta jelenlét a tünetmentes hajtások és növények révén a fertőzöttség szóródását okozhatja.

A betegség megelőzésére és kordában tartására – hatékony baktériumölő szerek hiányában – rezisztens növények kifejlesztése tűnik a legjobb megoldásnak. Jelenleg nem ismerjük a különböző leanderfajták eltérő virulenciájú Psv törzsekkel szembeni rezisztenciáját. Egy Dél-Olaszországi vizsgálat azt mutatta, hogy a legtöbb leandert érinti a fertőzöttség, és néhány fajta esetén akár a teljes virágzási periódusra és a magképződésre kihatással van. A Leander/Psv kölcsönhatás további vizsgálatokat igényel.

A vizsgálatokban tanulmányozták néhány közismert leanderfajta eltérő virulenciájú Psv törzsekkel szembeni rezisztenciáját és kidolgoztak egy in vitro pathogenitási tesztet a PSV törzsek vizsgálatára.

csomosszar
fotó eredete: http://wiki.bugwood.org/Pseudomonas_savastanoi

 

Anyag és módszer

 

Növények és baktériumok

Kelet-Szicília egyik legjelentősebb kertészetéből származó 9 leander variánst vizsgáltak. A kísérlethez egyéves gyökereztetett hajtásokat használtak, amelyeket 18×14 cm-es cserepekbe ültetve (2 hajtás/cserép) a kísérlet ideje alatt növényházban tartottak.

10 Psv izolátumot vizsgáltak, amely közül 9 a katániai egyetem növény-egészségügyi tanszékéről származott és egy korábbi vizsgálat során eltérő kórokozó képességet mutattak. A leanderben mutatkozó tünetek súlyossága alapján 3 csoportba sorolták őket: az I. csoport tagjai a hajtásokon súlyos rákos, nekrotikus elváltozásokat okoztak, másodlagos csomók alakultak ki a leveleken, a terméstokok deformáltak voltak; a II. csoport tagjainál az oltás helyén képződtek csomók; a III. csoportnál az oltás helyén sem volt tünet megfigyelhető, de a leveleknél „víz áztatta” területek voltak megfigyelhetők. A 10. törzs az ITM519 jelölésű referens törzs volt, amelyet számos korábbi vizsgálatban is használtak.

 

Leander variánsok in vivo (természetszerű kísérleti körülmények) szűrése

A legvirulensebbtől a legkisebb megbetegítő képességűig 3 Psv törzset kiválasztva (I., II., III. csoportbeli) minden leander variánsból 10-10 db-ot fertőztek velük. Egyéves leanderek fiatal hajtásait oltották, a baktériummal fertőzött tűvel 3 csomóköznél megszúrták a szárat. A kontrol növényeket steril tűvel szúrták meg.

Tíz, 20, 30, 60 és 120 nappal később feljegyezték a talált tüneteket. A gazdanövény-baktérium kölcsönhatást a szúrással fertőzött száron kialakult elsődleges tünetek alapján jellemezték, 4-es skálán meghatározva a növény érzékenységét: 0= nincs tünet; 1 = helyi csomók az oltás helyén; 2 = hajtás deformálódása; 3 = a hajtás deformálódása és a csúcs elhalása. A másodlagos csomók megjelenését a leveleken, virágokon és magtokokon szintén vizsgálták és meghatározott időpontban számításba vették a csoportok minősítésénél.

A fertőzés létrejöttét a fertőzés pontjától távol kialakult másodlagos csomókból, ill. a szár deformitásokból, hajtáscsúcsból és termésből történő kórokozó izolálásával erősítették meg. A vizsgálandó rész felszínét fertőtlenítették, majd összedarálva desztillált vízben szuszpendálva táptalajra oltották. A kinövő telepeket – kétséges esetben molekuláris biológiai módszereket is felhasználva – azonosították.

 

In vitro fertőzési teszt kidolgozása

Különböző leander részeket vizsgáltak meg gyors és nem károsító fertőzési teszt kidolgozása céljából. A kísérletben 10 Psv törzs kórokozó képességét vizsgálták a „Rózsaszín” (szimpla rózsaszín virágú) leander fajta fertőzésével. Fiatal szár és levélrészeket 5 percig csapvízzel mostak, majd 1 percig 70 %-os alkohollal fertőtlenítettek és steril desztillált vízzel leöblítettek. Hajtásokat 0,5 és 1,5 cm-es darabokra vágtak (9 és 6 szárdarab/fertőző törzs). A fertőtlenített leveleket steril szikével 1,5 cm-es darabokra vágták, minden levélből 5 darabkát nyerve. A hajtások fertőzésénél közvetlenül a vágási felületre vitték a fertőző anyagot, míg a levelek esetén a középső érbe tűszúrással vitték be a fertőzést. Az oltott darabkákat 16/8 órás megvilágítás/sötétség fényperiódussal 0,5 %-os vizes agaron 28oC-on tenyésztették. Hetente nézték a tünetek megjelenését. A pozitív oltáshelyeket a kísérlet végén számolták össze. A betegségi indexet (DI) a pozitív oltási helyek és a csomók nagysága alapján határozták meg: 0 = nincs csomó; 1 = max 1mm; 2 = 1-3 mm; 3 = > 3mm.

A levéltesztet ugyancsak elvégezték a „Rózsaszín” fajtával, valamint a fertőzés iránt legérzékenyebb „Sötét lazac” és legellenállóbb „Fehér” leander variánssal. Fajtánként 12-12 levelet oltottak 1-1, az eltérő virulencia csoportba {I (89.1), II (83), III (99.2)} tartozó 3 Psv törzzsel. A leveleket a fentebb leírt módon kezelték. A pozitív csomókat, a csomók nagyságát a fertőzést követő 7., 15. és 30. napon vizsgálták, majd az eredményekből DI értéket számoltak.

 

Eredmények

A leander variánsok in vivo Psv fertőzésre adott válasza

Tíz nappal a fertőzés után az oltás helyén nekrózis és ”korhadás” jelentkezett. A 89.1 és 83 fertőzés esetén 51 és 48 % volt a tünetet mutató oltáshelyek száma, míg a 99.2 törzsnél ez a szám csak 8 % volt. 20 nappal az oltás után a 89.1 törzs esetén a korhadási tünetek fokozódtak és az oltás körül hiperplázia (szöveti túlburjánzás) volt tapasztalható. Kifejezett csomóképződés, néha másodlagos csomók csak néhány növény esetén voltak megfigyelhetőek 30 nappal az oltás után. Két hónappal a fertőzés után lokalizált csomók és/vagy másodlagos csomók jelentkeztek a 89.1 és 83-al fertőzött növények mindegyikén, míg a 99.2 törzs esetén ez a szám csak 61 % volt.

A betegségi index (DI) 0 és 6.3 között változott a leander fajtájától és a fertőző törzstől függően. A legérzékenyebb a „Sötét lazac” fajta volt átlagos 4,07 DI-vel, ez szignifikánsan magasabb volt az összes többinél. Ennél a fajtánál a 89.1 és a 83 fertőzés a hajtások elhalásához vezetett. A „Sötét lazac” mellett a „Törpe lazac” (DI 2,66) és a „Lazac” (DI 2,44) fajták ugyancsak nagyfokú érzékenységet mutattak, a hajtás, a levelek és a magtok nagyfokú torzulása és másodlagos csomók megjelenése volt tapasztalható. A legkevésbé érzékeny a „Fehér” fajta (DI 1,0) volt, az oltás helyén lokális csomók alakultak ki, néha másodlagosak is megfigyelhetők voltak, de sem hajtás deformáció, sem a virág vagy a magtok torzulása nem volt tapasztalható. A többi fajta átlagos DI-je 1,27 és 1.8 között volt.

A 89.1 (DI 2,33) és 83 (DI 2,59) által okozott tünetek egymáshoz viszonyítva nem mutattak szignifikáns különbséget, de mindkettő szignifikánsan különbözött a 99.2 (DI 0,99) törzstől.

A 99.2 fertőzés nem vezetett betegség kialakulásához a „Fehér” és a „Lazac” fajtáknál.

A fertőző Psv törzs mindenkor visszaizolálható volt a tüneteket mutató növényekből.

A betegség lefolyási görbéje összhangban volt a DI-vel, ahol a „Sötét lazac” mellett a „Törpe lazac” és a „Lazac” fajták voltak legérzékenyebbek. A tünetek korai megjelenése a 89.1 törzsnél ugyanezt támasztotta alá.

Sérült levél, melyben a baktériumok könnyen megtelepedhetnek.

 

In vitro levélteszt

Eredendően szár és levéldarabokat oltottak a 10 Psv törzzsel. Egy héttel a fertőzés után mind a szár-, mind a levéldarabok esetén kifejezett baktériumszaporodás volt megfigyelhető az oltás helyén. Az oltás helyén nem alakult ki elváltozás 99 db. 0,5 cm hosszú szárdarabnál. A 66 db 1,5 cm hosszú szárdarab esetén a felső rész megvastagodása volt megfigyelhető 17 esetén, de ezt nem minden törzs indukálta. A leveleknél 7 nappal a fertőzés után jelentek meg az első tünetek apró gyulladások vagy csomók formájában. Egy hónappal a fertőzés után a fertőző törzstől függően 1-5 mm-es apró csomók voltak megfigyelhetők a 300 db. oltott levél közül 117-en. Ezek az eredmények alapján a levélteszt alkalmazása mellett döntöttünk, mert a tünetek itt jól definiálhatók és a csomók nagysága is mérhető. A vizsgált Psv törzsek 0,08 és 1,73 közötti eltérő DI értékeket mutattak. Három törzs 0,2 alatti DI értékkel szignifikánsan alacsonyabb virulenciájú volt, mint a többi, a 0,76 fölötti DI értéket mutató törzsek. A levéltesztet használták a legérzékenyebb „Sötét lazac” és legrezisztensebb „Fehér”, valamint a „Rózsaszín” (szimpla rózsaszín virágú) leander variáns vizsgálatára. A 87,1 és 93,1 Psv törzseket választották ki egy korábbi, a „Rózsaszín” (szimpla rózsaszín virágú) leander variánson végzett vizsgálat alapján (Bella 2001). Virulenciájuktól függetlenül mindkét törzs csomókat idézett elő a fertőzött leveleken, de a kialakulás sebessége változó volt a leanderfajtáktól, ill. a fertőző törzstől függően. A „Sötét lazac” és a „Rózsaszín” variánson a „Fehér”-nél gyorsabban alakultak ki a csomók. Egy héttel a fertőzés után a 87,1 Psv törzs 100%, 47% és 31 %-ban okozott csomót a „Rózsaszín”, a „Sötét lazac” és a „Fehér” variánson. A 93,1 törzsnél ezek az értékek 100%, 47% és 5 % voltak. Bármelyik törzzsel oltva a variánsokat a megfigyelési idő 1 hónapja alatt a csomók száma folyamatosan nőtt, a hamarabb reagáló fajtáknál nagyobb csomók alakultak ki. A 3 eltérő leander variáns a fertőzést követő 7. napon már szignifikáns különbséget mutatott a Psv fertőzéseknél, ezt a különbséget a 15. és 30. napi megfigyelés eredménye is megerősítette. Ez az in vitro levélkísérlet is megerősítette, hogy a „Sötét lazac” érzékenyebb a fertőzés iránt, mint a „Fehér”. A csomók mérete a fertőző 87,1 és 93,1 Psv törzsek esetén az egyes variánsoknál is szignifikánsan különbözött, megerősítve a 87,1 törzs nagyobb mértékű virulenciáját.

 

Megbeszélés

Megfigyelhető volt, hogy a 9 leanderfajta eltérően reagált a 3 eltérő virulenciájú Psv törzzsel történt fertőzésre, valamint hogy egyik variáns sem volt tökéletesen rezisztens a fertőzéssel szemben. A legérzékenyebb „Sötét lazac” és a legrezisztensebb „Fehér” variáns érzékenysége egyértelműen megkülönböztethető volt a kidolgozott in vitro levéltesztben.

Az egyes Psv törzsek eltérő virulenciája ugyancsak megerősítést nyert, és a korábbiakhoz képest új eredmény, hogy az előzőleg elkülönített I. és II. virulencia csoport nem különül el, hanem egységes csoportot képezve szignifikáns különbséget mutat a III. csoporttal összehasonlítva.

Miután a leanderek a fertőzés hatására változatos és komplex tünet együttest produkáltak, a tüneteket 0-4 érzékenységi skála bevezetésével minősítettük. A fertőzés helyén kialakuló elsődleges csomók és a fertőzés terjedési útján kialakuló másodlagos csomók torzulásokat okoztak a növény különböző részeiben. A kidolgozott teszt alkalmasnak tűnik az elváltozások értékelésére.

A variánsok eltérő érzékenysége a vizsgált – ugyancsak különböző – Psv törzsekre a gazdaszervezet – kórokozó közötti nagyfokú válaszreakció változatosságot mutatta. Ezek részben a törzsek eltérő virulenciájából következtek, ezért a kísérletek előtt tanácsos a törzsek pathogenitásának felmérése. Említésre méltó, hogy a „Fehér” fajta esetén a kevéssé pathogén törzsek esetén csak az oltás helyén alakultak ki csomók, vagy még ott sem. Ezzel ellentétben a „Sötét lazac” variánsnál súlyos deformitások, sőt a hajtás elhalása is kialakult.

A betegség 1928-as leírása óta nyilvánvalóvá vált, hogy a fertőzés során másodlagos csomók is kialakulnak, a fertőzés pedig a hajtás kéregállományában található tejutakban terjed, és nincs kapcsolatban a növény szállítórendszerével. További vizsgálatra szorul azonban, hogy a tejutakban történő terjedés összefüggésbe hozható-e a betegséggel szembeni rezisztenciával.

A leander szisztémás fertőződése behatárolja az in vivo vizsgálati lehetőséget, mert növényenként csak egy fertőzés történhet, ezért a hajtást vagy levelet alkalmazó in vitro teszt került kidolgozásra.

Kísérleti körülmények között az in vitro levélteszt egyszerű és gyors módszer a pathogenitás vizsgálatára, mert a csomók itt az in vivo növényfertőzéssel szemben már 7 nappal a fertőzés után megjelennek, míg in vivo esetben csak a fertőzést követő 20-30 nap múlva. Így – különösen laboratóriumi körülmények esetén – a teszt megfelelőnek tűnik pathogenitási vizsgálatok lefolytatására, és ugyancsak alkalmas nagyszámú törzs és mutáns gyors szűrésére. A teszt eredményei megerősítették mind a Psv törzsek virulencia különbségeit, mind az egyes leanderfajták eltérő betegség iránti fogékonyságát.

 

Az összefoglaló az alábbi közlemény felhasználásával készült:

Bella, P., Cataraz, V., Guarino, C. és Cirvilleri, G. (2006) Evaluation of Oleander accassions for resistance to Pseudomonas savastanoi pv. nerii

Journal of Plant Pathology, 88. (3) 273-278. old.

 

Fordította: Varga Zsuzsanna